描述

CHO 残留 DNA 检测试剂盒(探针法）

 

【产品规格】

CHO 100 100 Reactions/盒

【产品说明】

Biowing® CHO 残留 DNA 检测试剂盒用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中 CHO 宿主细胞 DNA。

本试剂盒采用一套引物探针在FAM通道定量检测样品中 CHO 残留 DNA，另外一套引物探针在HEX通道检测内参DNA。

该试剂盒具有以下特点：

灵敏：最低检测限可低至1 fg/μL。

简单：标曲定量参考品预分装并冻干，绘制标曲简单。

可靠：试剂盒配套有CHO DNA 定量参考品，已溯源至国家标准品；抽提加入内参核酸，全过程质量控制。

准确：样品加标回收，评估 DNA 提取的效率、回收率和准确度，评估验证分析方法和系统性能，进一步保证结果的准确性。

快捷：操作时间短，3 h内出结果。

【运输及保存条件】

低温冷冻运输，-20 ℃保存，有效期1年；使用后仍存放在

-20 ℃，不可反复冻融超过三次。

【产品组分】

A:



B:

 

注：本试剂盒提供的其他试剂，使用前先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用。

【操作步骤】

1. 产品组分的复溶

Biowing®CHO Primer&Probe Mix、内部质控（IC）、CHO DNA 定量参考品（1 pg/μL）用12000 rpm 离心2 min后，分别用242 μL/管和220 μL/管、275 μL/管RNase Free Water复溶，混匀1min后瞬离。

2. qPCR 反应液的准备

（1）根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，每个样本做3复孔。

反应孔数=1个无模板对照NTC+1个阴性质控 NCS+（5个浓度梯度的标准曲线+样本数+加标回收质控 ERC）×3

（2）根据反应孔数计算所需的qPCR Mix 总量（需有1孔的加样损失量）：

Mix =（反应孔数+1）×20 μL

（3）各试剂放室温融化，并根据下表所示准备 qPCR Mix：

表2 qPCR Mix的配制



3. 样本制备（自备）

v 配制 CHO DNA 标准曲线

（1）取三条含CHO DNA 标准曲线定量参考品的8连管；

（2）5000 rpm离心10min；

（3）8连管的前五个孔中每个孔加入10μL RNase Free Water；

（4）涡旋振荡混匀，短暂离心 5 秒；

（5）浓度依次为10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL。

v 待测样品的制备

（1）取 200 μL 待测样本加入 1.5 mL 干净的离心管中，再加入 10 μL IC，标记为样品。

（2）待测样品进行样品抽提前处理，制备成样品纯化液。

v 加标回收质控 ERC 的制备

根据需要设置 ERC 中的 CHO DNA 加样浓度（以制备加 10 pg CHO DNA 量的样品 ERC 为例），具体操作如下：

（1）取 200 μL 待测样品加入 1.5 mL 干净的离心管中。

（2）加入 10 μL CHO DNA 定量参考品（1 pg/μL），再加入 10 μL IC，混匀，标记为样品 ERC。样品 ERC 和同批待测样品一起进行样品抽提前处理，制备成样品 ERC 纯化液。

v 阴性质控 NCS 的制备

（1）取 200 μL RNase Free Water加入 1.5 mL 干净的离心管中，再加入 10 μL IC，标记为阴性质控 NCS。

（2）同待测样品一起进行样品抽提前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。

注：样本抽提前处理具体见附录1

4. 加样

qPCR 反应体系及条件反应体系以30µL为例：

（1）震荡混匀 qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。

（2）向每孔反应管/CHO DNA 标准曲线定量参考品反应管中分装 20 μL qPCR Mix。

（3）向已分装过 qPCR Mix 的反应管中加入15 μL石蜡油。

（4）向反应管中穿过石蜡油层加样，3000 rpm 瞬离5 s，加样示例如下：

表 3 加样示例



注：建议其他不同类型样本，先做适应性验证，因为不同样本性质不同。

PCR 仪设置以ABI 7500 为例，相对定量模式，选择TaqMan 探针法：



【阈值设置】

以ABI 7500 为例，扩增曲线选择 log 法，基线设置3-15个循环。建议用 log 法扩增曲线保证结果稳定可靠。

（1） 内参(HEX/VIC)阈值设定：以阴性质控 NCS定内参扩增曲线阈值，将内参的Ct 值定为 28±2。

（2） CHO(FAM)阈值设定：以标曲最高浓度定CHO扩增曲线阈值，将CHO(FAM)的Ct值定为19±2。

【结果判读】

根据CHO(FAM) Ct 值判定是否发生CHO残留，具体标准如下：



1. 检查内参通道扩增是否正常，扩增曲线是否选择log 法。

2. 内参扩增不正常，表明 PCR反应未正常进行，PCR 体系受到干扰，需重复检测。

3. 内参扩增正常，结合 Ct 值和扩增曲线形态判断。

4. 无典型扩增曲线，可认为该样本为CHO无残留。有典型扩增曲线，需重复检测，重复结果不一致判为无残留；结果一致，判为有残留。

5. 根据待测样品和样品ERC的检测结果计算加样回收率，加样回收率要求在50%～150%之间，具体算法见附录4。

6. 上机结束后，在程序的右上角点击“plate setup” 栏下的“Assign Targets and Samples/Assign target(s) to the selected wells”，选中标准品的反应格，在右侧的“Task”栏 下选择“ ”，设置好每个梯度的重复孔，在“Quantity”下输入所做的浓度，依次将标准品的梯度设置完成。

7. 点击“Analysis”栏下的“Standard Curve”即可读取标准曲线的R²、扩增效率（Eff%）和斜率（Slope）；正常的标曲：R²＞0.99；扩增效率在 90%≤Eff%≤110%范围内；Slope 在-3.4 左右。

【注意事项】

由于 PCR 反应非常灵敏，实验操作中应注意以下事项，以免发生DNA 污染：

1. 建议分区操作和分区存放。

A区：样本DNA提取，建议在超净工作台完成；

B区：配制mix和qPCR阴性加样，建议在超净工作台完成；

C区：按照先加待测样本，后配制标曲的顺序加样；

D区：qPCR扩增检测。

2. 建议在 qPCR 反应板上阳性对照的排布应远离待测样本和阴性对照；使用不同的移液器添加阳性对照与待测样本、阴性对照，并使用带滤芯的枪头进行加样。

3. 试剂盒开启后，试剂 Mix、阴性对照存放在B区，阳性对照应存放在C区。

4. qPCR 封膜时须反复压紧。

5. 每周用核酸清除剂清洁无菌操作台、传递窗和桌面。

6. 垃圾建议当场封闭并丢弃。

7. 对具体样品的 DNA 加标量设定在其无加标测试值的 2-10 倍为宜。

8. 本产品仅作科研用途。




【附录 1 样本抽提前处理方案】

在实验前请完整阅读本说明书，务必重视注意点！

n 样品处理




样品可手工抽提，也可机器抽提。

核酸抽提注意事项

 

Ø 请尽量在完成样品纯化处理当天进行后续的 DNA 检测，以保证检测结果的准确性。

Ø 手抽提取纯化操作过程建议在二级生物安全实验室或安全柜中进行。




手抽样品制备期间:

Ø 小心地将样品溶液加到核酸吸附柱上。枪头中的样品进入核酸吸附柱而不湿润柱的边缘。

Ø 不同液体在转移之间更换枪头。使用带滤芯的枪头。

Ø 避免用枪头接触核酸吸附膜。




【附录 2相关设备耗材】




n 实验所需但试剂盒中未含材料

Ø RNase Free Water

Ø 无水乙醇（分析纯）

Ø PCR 8 连管或 96 孔板，相应管盖或覆膜

Ø 1000μL，100μL，10μL 无菌低吸附滤芯枪头

Ø 1.5mL，2mL 无菌低吸附离心管




n 相关设备

Ø 迷你离心机

Ø 漩涡振荡器

Ø 金属浴

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

Ø 荧光定量 PCR 仪

Ø 生物安全柜

Ø 微孔板迷你离心机
















【附录 3 无菌操作规范】

无菌操作规范

 

1、除高速离心机外，其他设备和耗材应放在无菌操作台中，保证无菌。

2、样本高速离心后，要对离心管喷酒精，并用棉球擦拭离心管外壁，同时更换干净的板架和新手套。

3、实验前用1% 84消毒液擦净台面及四周，放好需用的实验器材及各种溶液，并用酒精棉球擦拭，更换干净的管架。

4、对着桌面，空间喷洒1% 84消毒液，然后将超净工作台通风机打开，超净工作台和紫外灯打开 30～45 分钟，再将无菌室紫外灯打开 30～45 分钟后关闭，再通风 15 分钟。关闭紫外，拉开小一半隔离，用酒精棉球擦拭超净工作台桌面2遍，关上隔离。

5、进入无菌室操作前，双手在操作台内手臂部分用75%的酒精擦拭消毒。穿专用工作服、帽及拖鞋、口罩，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。

6、无菌室温度宜控制在 18～28 ℃，湿度在 45%～65%（温湿度计应该用无水的）。

7、从枪头盒中取出枪头时，尖部不能触及外露部位及离心管和管架边。

8、操作尽量在酒精灯前操作。打开离心管前，酒精灯灼烧镊子，待冷却后用镊子开关管盖。

9、操作中，不能在样品上方翻转瓶盖，袖口不能掠过样品上方。

10、实验完毕，清洁台面。

11、实验者在实验后用肥皂清洗双手。

12、换下的专用实验服，进行紫外线，一次性鞋套额帽子扔进垃圾桶。

13、用毕，再开紫外灯消毒 30 分钟。

14、无菌室和缓冲间定期大扫除，保持整洁。

15、定期检查紫外灯灯管。每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。如灯管发黑，超过使用期限，及时更换紫外灯管。

16、每周用核酸清除剂清洁无菌操作台、传递窗和桌面。

17、垃圾建议当场封闭并丢弃。




2、注意事项

(1)工作台面上，禁止存放不必要的物品，以保证工作区域内的洁净气流不受干扰。

(2)禁止在工作台面上记录，工作时应尽量避免作明显扰乱气流的动作。(3)根据环境洁净度，每 3~6 个月将中效过滤器中的滤料拆下清洗。一般情况下，当无纺布滤料容纳尘埃较多、表面发黑时即可拆下进行清洗，或者予以更换。

(4)风机转速调至最大时，仍不能达到所需要的风速时（即风速≤0.2m/s）,则必须更换高效空气过滤器。







【附录 4 核酸抽提仪日常清洁】




核酸抽提仪日常清洁

 

1．每周用核酸清除剂清洁一次，推荐使用近岸蛋白的Nucleic Acid Cleaner（M126-01A）。

2．每天实验结束后用1% 84消毒液喷核酸抽提仪台面和四周，然后用纸擦净。

3．每天下班前打开核酸抽提仪的门通风过夜。

4．如遇核酸抽提仪污染特别严重，可以先用清水先擦拭3遍，再用核酸清除剂和1% 84消毒液清洁，最后用纸擦净。

5．实验前，用84擦拭仪器和紫外照射约2.5个小时。







【附录 4 样品回收率】

1、标准曲线的构建

以标准品 5个浓度梯度下的平均Ct值为纵坐标，5个梯度的Log10上样量为横坐标，构建标准曲线。





2、利用标准曲线计算样品回收率

(按照加入1 pg/µl CHO DNA 参考品计算）



注:洗脱体积按照100uL计算