描述

【产品规格】

        TL3-S&C   3 Tests

【产品说明】

该产品为已纯化的基因组DNA，用于 qPCR 标准曲线的绘制和校正系数的计算。

【运输及保存条件】

低温冷冻运输，-20℃保存，有效期6个月。

【产品组分】



标准品和校正品先12000 rpm离心5 min，离心后小心开启，每管再分别用60 µL RNase Free Water复溶。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用。

【操作步骤】

1、qPCR 标准曲线的绘制

1.1  标准品质量的标化

标准品DNA和校正品DNA经DNA纯化液纯化后，用DNA分选磁珠进行分选，具体操作步骤见端粒长度DNA纯化试剂盒说明书（TL50-P）。

1.2  标准品浓度的稀释

DNA磁珠分选后的标准品中的DNA标化为8 ng/µL，体积为40 µL（标为管1），从管1中吸取20 µL，加入到管2中，另外加入20 µL RNase Free Water（客户自备）

得到溶液2；在管3中加入20 µL溶液2，另外加入20 µL RNase Free Water得到溶液3。连续的稀释方法得到标准曲线R2可达到0.99左右。



1.3 校正品浓度的稀释

DNA磁珠分选后的校正品中的DNA标化为4 ng/µL，体积为20 µL。

2、加样

各反应孔加样示例



3、结果与计算

3.1 标准曲线的构建

以标准品3个 浓度梯度下的平均 Ct值为横坐标 ， 3个梯度 的 Log2上样量为纵坐标，构建标准曲线图示：

表1 标准品端粒通道Ct值





表2 标准品内参通道Ct值

 



3.2 利用标准品标准曲线计算校正品的T/S

将校正品的端粒和内参通道的Ct 值代入标准曲线方程，即可得到校正品的T/S。

表3 校正品的T/S计算过程

 

3.3 校正系数的计算

已对标准品和校正品的端粒长度做TRF检测，绝对端粒长度已知（假定标准品的绝对长度为5430 bp，校正品的绝对长度为5100 bp），按照下图示即可得到   用于校正样品的校正系数。

表4 校正品的校正系数



3.4 样本T/S以及绝对长度的计算

表5 样本的T/S计算



本表中校正系数源自表4中计算出的校正系数，本表中标准品绝对长度为5430 bp。

注：样品及标准品浓度过高或过低会影响扩增效率，对实验造成干扰，测量结果误差较大。

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